一、無菌操作要求

1. 接種細(xì)菌時(shí)必需穿任務(wù)服、戴任務(wù)帽。

2. 停止接種食品樣品時(shí)，必需穿公用的任務(wù)服、帽及拖鞋，應(yīng)放在無菌室緩沖間，任務(wù)前經(jīng)紫外線消毒后運(yùn)用。

3. 接種食品樣品時(shí)，應(yīng)在進(jìn)無菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球?qū)⑹植翝崈?/b>。

4. 停止接種所用的吸管，平皿及培育基等必需經(jīng)消毒滅菌，翻開包裝未運(yùn)用完的器皿，不能放置后再運(yùn)用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精撲滅炙烤三次后運(yùn)用。

5. 從包裝中取出吸管時(shí)，吸管尖部不能觸及外露部位，運(yùn)用吸管接種于試管或平皿時(shí)，吸管尖不得觸及試管或平皿邊。

6. 接種樣品、轉(zhuǎn)種細(xì)菌必需在酒精燈前操作，接種細(xì)菌或樣品時(shí)，吸管從包裝中取出后及翻開試管塞都要經(jīng)過火焰消毒。

7. 接種環(huán)和針在接種細(xì)菌前應(yīng)經(jīng)火焰炙烤全部金屬絲，必要時(shí)還要燒到環(huán)和針與桿的銜接處，接種結(jié)核菌和烈性菌的接種環(huán)應(yīng)在沸水中煮沸5min，再經(jīng)火焰炙烤。

8. 吸管吸取菌液或樣品時(shí)，運(yùn)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。

二、無菌間運(yùn)用要求

1. 無菌間通向外面的窗戶應(yīng)為雙層玻璃，并要密封，不得隨意翻開并設(shè)有與無菌間大小相應(yīng)的緩沖間及推拉門，另設(shè)有0.5~0.7m2的小窗，以備進(jìn)入無菌間后傳遞物品。

2. 無菌間內(nèi)應(yīng)堅(jiān)持清潔，任務(wù)后用2%~3%煤酚皂溶液消毒，擦拭任務(wù)臺(tái)面，不得寄存與實(shí)驗(yàn)有關(guān)的物品。

3. 無菌間運(yùn)用前后應(yīng)將門關(guān)緊，翻開紫外燈，如采用室內(nèi)懸吊紫外燈消毒時(shí)，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時(shí)間不少于30min，運(yùn)用紫外燈，應(yīng)留意不得直接在紫外線下操作，以免惹起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球悄然擦拭，除去下面灰塵和油垢，以增加紫外線穿透的影響。

4. 處置和接種食品標(biāo)本時(shí)，進(jìn)入無菌間操作，不得隨意出入，如需求傳遞物品，可經(jīng)過小窗傳遞。

5. 在無菌間內(nèi)如需求裝置空調(diào)時(shí)，則應(yīng)有過濾裝置。

三、消毒滅菌要求

微生物檢測(cè)用的玻璃器皿、金屬用具及培育基、被污染和接種的培育物等，必需經(jīng)滅菌前方能運(yùn)用。干熱和干冷高壓蒸氣鍋滅菌方法。

1.滅菌前預(yù)備 （1）一切需求滅菌的物品首先應(yīng)清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴(yán)密，如用金屬筒應(yīng)將下面通氣孔翻開。 （2）裝培育基的三角瓶塞，用紙包好，試管蓋好蓋，注射器須將管芯抽出，用紗布包好。

2.裝放 （1）干熱滅菌器：裝放物品不可過擠且不能接觸箱的四壁。 （2）大型高壓蒸氣鍋：放置滅菌物品區(qū)分包扎好，直接放入消毒筒內(nèi)，物品之間不能過擠。

3.設(shè)備反省 （1）反省門的開關(guān)能否靈敏，橡皮圈有無損壞，能否平整。 （2）反省壓力表蒸氣排盡時(shí)能否停留在零位，關(guān)好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察能否漏氣，壓力表與溫度計(jì)所標(biāo)示的狀況能否吻合，管道有無梗塞。 （3）對(duì)有自動(dòng)電子順序控制裝置的滅菌器，運(yùn)用前應(yīng)反省規(guī)則的順序，能否契合于停止滅菌處置的要求。

4.滅菌處置

(1)干熱滅菌法： 此法順應(yīng)于在干熱狀況下，不損壞、不蛻變、不蒸發(fā)的物品、較常用于玻璃器皿、金屬制品、陶瓷制品等的滅菌。 ① 器械器皿應(yīng)清洗后再干烤，以防附著在外表的污物炭化。 ② 滅菌時(shí)安放物品不能過擠，不要直接接觸底和箱壁，物品之間留有空隙。 ③ 滅菌時(shí)將箱門關(guān)緊，接上電源，先將排氣孔翻開約30min，掃除滅菌器中的冷空氣，溫度升至160℃調(diào)理指示燈，維持1.5~2h。 ④ 滅菌終了后或溫度升溫進(jìn)程中，須在60℃以下才干翻開箱門。

(2)手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的運(yùn)用應(yīng)按下列步驟停止： ① 手提式高壓鍋在主體內(nèi)參與3L清水，立式高壓鍋加水16L（重復(fù)運(yùn)用時(shí)應(yīng)將水量補(bǔ)足，水變混濁需改換）； ② 手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管拔出消毒桶內(nèi)壁的方管中（無軟管或軟管銹蝕分裂的滅菌器不得運(yùn)用）； ③ 蓋好頂蓋擰緊，勿使漏氣；置滅菌器于火源上加熱，立式壓力鍋通上電源，并翻開頂蓋上的排氣閥放了冷氣（水沸騰后排氣10~15min）； ④ 封鎖排氣閥，使蒸氣壓上升到規(guī)則要求，并維持規(guī)則時(shí)間（按滅菌物品性質(zhì)與有關(guān)狀況而定）； ⑤ 到達(dá)規(guī)則時(shí)間后，對(duì)需枯燥的物品，立刻翻開排氣閥排出蒸氣，待壓力恢復(fù)到零時(shí)，自然冷卻至60℃后開蓋取物，如為液體物品，不要翻開排氣閥，而應(yīng)立刻將鍋去除熱源，待自然冷卻，壓力恢復(fù)至零，溫度降到60℃以下，再開蓋取物，以防突然減壓液體猛烈沸騰或容器爆破。

(3)臥式壓力鍋蒸氣滅菌器的運(yùn)用按下列步驟停止： ① 關(guān)緊鍋門，翻開進(jìn)氣閥，將蒸氣引入夾層停止預(yù)熱，夾層內(nèi)冷空氣經(jīng)阻氣器自動(dòng)排出； ② 夾層到達(dá)預(yù)定溫度后，翻開鍋室進(jìn)氣閥，將蒸氣引入鍋室，鍋室內(nèi)冷空氣經(jīng)鍋室阻氣器自動(dòng)排出； ③ 待鍋室到達(dá)規(guī)則的壓力與溫度時(shí)，調(diào)理進(jìn)氣閥，使堅(jiān)持恒定； ④ 自然或人工降溫至60℃再開門取物，不得運(yùn)用快速排出蒸氣法，以防突然降壓，液體猛烈沸騰或容器爆破； ⑤ 運(yùn)用自動(dòng)順序控制式壓力蒸氣滅菌器，在放好物品關(guān)緊門后，應(yīng)依據(jù)物品類別按動(dòng)相應(yīng)開關(guān)，以便按要求順序自動(dòng)停止滅菌，滅菌時(shí)必需應(yīng)用附設(shè)儀表記載溫度與時(shí)間以備查，操作要求應(yīng)嚴(yán)厲依照廠家說明書停止；

5.滅菌溫度與時(shí)間 (1) 干熱滅菌器滅菌溫度160℃，1.5~2h。 (2) 壓力蒸氣滅菌鍋滅菌溫度與時(shí)間

四、間歇滅菌方法

1.滅菌方法： 應(yīng)用不加壓力的蒸氣滅菌，某些物質(zhì)經(jīng)高壓蒸氣滅菌容易破壞，可用此法滅菌。 （1）將欲滅菌物品置于鍋內(nèi)，蓋上頂蓋，翻開排水口，使器內(nèi)余水排盡。 （2）封鎖排水口，翻開進(jìn)氣門，依據(jù)需求消毒10~20min。 （3）滅菌終了封鎖進(jìn)氣門，取出物品待冷至室溫溫度，放入37℃溫箱過夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可到達(dá)滅菌目的。

2.血清凝結(jié)器運(yùn)用方法: 培育基中含有血清或雞蛋特殊成份時(shí)，因高熱會(huì)破壞其營(yíng)養(yǎng)成份，故用高溫，可使血清凝結(jié)，又可到達(dá)滅菌目的： （1）在運(yùn)用該法滅菌的血清等分裝時(shí)，需嚴(yán)厲遵守?zé)o菌操作，試管、平皿也經(jīng)滅菌后運(yùn)用； （2）將培育基按要求使成斜面或高層，加足水后，接上電源，升溫75~90℃一小時(shí)后滅菌，放37℃溫箱過夜，再如此滅菌三次。

3.煮沸消毒： 可用煮鍋或煮沸消毒器，水沸騰后再煮5~15 min，也可在水中參與2%石炭酸煮沸5min，參與0.02%甲醛，80℃煮60min均可到達(dá)滅菌目的，但選用煮沸消毒的增消劑時(shí)，應(yīng)留意對(duì)物品的腐蝕性。

4.滅菌處置: 滅菌后物品，按正常狀況已屬無菌，從滅菌器中取出應(yīng)細(xì)心反省放置，以免再度污染； （1）物品取出，隨即反省包裝的完整性，若有破壞或棉塞脫掉，不可作為無菌物品運(yùn)用； （2）取出的物品，如為包裝有清楚的水浸者，不可作為無菌物品運(yùn)用； （3）培育基或試劑等，應(yīng)反省能否契合到達(dá)滅菌后的色澤或形狀，未到達(dá)者應(yīng)廢棄； （4）啟閉式容器，在取出時(shí)應(yīng)將篩孔封鎖； （5）取出的物品掉落在地或誤放不潔處,或沾有水液,均視為遭到污染,不可作為無菌物品運(yùn)用； （6）取出的合格滅菌物品，應(yīng)寄存于貯藏室或防塵柜內(nèi)，嚴(yán)禁與未滅菌物品混放； （7）凡屬合格物品，應(yīng)標(biāo)有滅菌日期及有效期限； （8）每批滅菌處置完成后，記載滅菌品名、數(shù)量、溫度、時(shí)間、操作者。

五、有毒有菌污物處置要求

微生物實(shí)驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)器材、培育物等未經(jīng)消毒處置，一概不得帶出實(shí)驗(yàn)室。

1. 經(jīng)培育的污染資料及廢棄物應(yīng)放在嚴(yán)密的容器或鐵絲筐內(nèi)，并集中寄存在指定地點(diǎn)，待一致停止高壓滅菌。

2. 經(jīng)微生物污染的培育物，必需經(jīng)121℃，30min高壓滅菌。

3. 染菌后的吸管，運(yùn)用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中，*少浸泡24h（消毒液體不得低于浸泡的高度）再經(jīng)121℃，30min高壓滅菌。

4. 涂片染色沖洗片的液體，普通可直接沖入下水道，烈性菌的沖洗液必需沖在燒杯中，經(jīng)高壓滅菌前方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗濯。做凝集實(shí)驗(yàn)用的玻片或平皿，必需高壓滅菌后洗濯。

5. 打碎的培育物，立刻用5%煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時(shí)后再擦拭潔凈。

污染的任務(wù)服或停止烈性實(shí)驗(yàn)所穿的任務(wù)服、帽、口罩等，應(yīng)放入公用消毒袋內(nèi)，經(jīng)高壓滅菌前方能洗濯。

六、培育基制備要求

培育基制備的質(zhì)量將直接影響微生物生長(zhǎng)，由于，各種微生物對(duì)其營(yíng)養(yǎng)要求不完全相反，培育目的的不同，各種培育基制備要求如下：

1. 依據(jù)培育基配方的成分按量稱取，然后溶于蒸餾水中，在運(yùn)用前對(duì)運(yùn)用的試劑藥品應(yīng)停止質(zhì)量檢驗(yàn)。

2. pH測(cè)定及調(diào)理：pH測(cè)定要在培育基冷至室溫時(shí)停止，因在熱或冷的狀況下，其pH有一定差異，當(dāng)測(cè)定好時(shí)，按計(jì)算量參與堿或酸混勻后，應(yīng)再測(cè)試一次。培育基pH值一定要準(zhǔn)確，否則會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)或影響結(jié)果的觀察。但需留意因高壓滅菌可影響一些培育基的pH降低或降低，故不宜滅菌壓力過高或次數(shù)太多，以免影響培育基的質(zhì)量，指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等普通在調(diào)完pH后再參與。

3. 培育基需堅(jiān)持廓清，便于觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況，培育基加熱煮沸后，可用脫脂棉花或絨布過濾，以除去沉淀物，必要時(shí)可用雞蛋白廓清處置，所用瓊脂條要預(yù)先洗凈晾干后運(yùn)用，防止因瓊脂含雜質(zhì)而影響透明度。

4. 盛裝培育基不宜用鐵、銅等容器，運(yùn)用洗凈的中性硬質(zhì)玻璃容器為好。

5. 培育基的滅菌既要到達(dá)完全滅菌目的，又要留意不因加熱而降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，普通121℃，15min即可，如為含有不耐高熱物質(zhì)的培育基如糖類、血清、明膠等，則應(yīng)采用高溫滅菌或間歇法滅菌，一些不能加熱的試劑如亞碲酸鉀、卵黃、TTC、抗菌素等，待基礎(chǔ)瓊脂高壓滅菌后涼至50℃左右再參與；

6. 每批培育基制備好后，應(yīng)做無菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)及所檢菌株生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。假設(shè)是生化培育基，運(yùn)用規(guī)范菌株接種培育，觀察生化反響結(jié)果，應(yīng)呈正常反響，培育基不應(yīng)貯存過久，必要時(shí)可置4℃冰箱寄存。

7. 目前，各種枯燥培育基較多，每批需用規(guī)范菌株停止生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)或生化反響觀察，各種培育基用相應(yīng)菌株生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)良好前方可運(yùn)用，新購(gòu)進(jìn)的或寄存過久的枯燥培育基，在配制時(shí)也應(yīng)測(cè)pH，運(yùn)用時(shí)需依據(jù)產(chǎn)品說明書用量和方法停止。

8. 每批制備的培育基所用化學(xué)試劑、滅菌狀況及菌株生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果、制造人員等應(yīng)做好記載，以備查詢。

七、樣品采集及處置要求

1.所采集的檢驗(yàn)樣品一定要具有代表性，采樣時(shí)應(yīng)首先對(duì)該批食品原料、加工、運(yùn)輸、貯藏方法條件、周圍環(huán)境衛(wèi)生狀況等停止詳細(xì)調(diào)查，反省能否有污染源存在。

2.依據(jù)食品的種類及數(shù)量，采樣數(shù)量及方法應(yīng)按規(guī)范檢驗(yàn)方法的要求停止。

3.采樣應(yīng)留意無菌操作，容器必需滅菌，防止環(huán)境中微生物污染，容器不得運(yùn)用煤酚皂溶液，用新潔爾滅、酒精等消毒藥物滅菌，更不能含有此類消毒藥物或抗生素類藥物，以防止殺死樣品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可運(yùn)用。

4.樣品采集后應(yīng)立刻送往檢驗(yàn)室停止檢驗(yàn)，送檢進(jìn)程中普通不超越3h，如，路程較遠(yuǎn)，可保管在1~5℃環(huán)境中，如需冷凍者，則在凍存形狀下送檢。

5.檢驗(yàn)室收到樣品后，停止注銷（樣品稱號(hào)、送檢單位、數(shù)量、日期、編號(hào)等），觀察樣品的外觀，假設(shè)發(fā)現(xiàn)有下列狀況之一者，可拒絕檢驗(yàn)： (1)樣品經(jīng)過特殊高壓、煮沸或其他方法殺菌者，失掉代表原食品檢驗(yàn)意義者； (2)瓶、袋裝食品已啟開者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失掉原食品外形者（食物中毒樣品除外）； (3)按規(guī)則采樣數(shù)量缺乏者； 對(duì)送檢契合要求的樣品，檢驗(yàn)室收到后，應(yīng)立刻停止檢驗(yàn)，假設(shè)條件不具有，應(yīng)置4℃冰箱寄存，及時(shí)預(yù)備發(fā)明條件，然后停止檢驗(yàn)。

6.樣品檢驗(yàn)時(shí)，依據(jù)其不異性狀，停止適當(dāng)處置。 (1)液體樣品接種時(shí)，應(yīng)充沛混合平均，按量吸取停止接種。 (2)固體樣品，用滅菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225mL滅菌生理鹽水或其他溶液中，用均質(zhì)器攪碎混勻后，按量吸取接種。 (3)瓶、袋裝食品運(yùn)用滅菌操作啟開，依據(jù)性狀選擇上述方法處置后接種。

八、 樣品檢驗(yàn)、記載和報(bào)告的要求

1. 檢驗(yàn)室收到樣品后，首先停止外觀檢驗(yàn)，及時(shí)依照國(guó)度規(guī)范檢驗(yàn)方法停止檢驗(yàn)，檢驗(yàn)進(jìn)程中要仔細(xì)、擔(dān)任、嚴(yán)厲停止無菌操作，防止環(huán)境中微生物污染。

2. 樣品檢驗(yàn)進(jìn)程中所用方法、出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果等均要用文字寫出實(shí)驗(yàn)記載，以作為對(duì)結(jié)果剖析、判定的依據(jù)，記載要求詳細(xì)、清楚、真實(shí)、客觀、不得涂改和偽造。

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? NGS技術(shù)在臨床上的運(yùn)用逐漸趨于成熟，從早期的腫瘤基因檢測(cè)，到如今大熱的微生物病原核酸檢測(cè)，NGS技術(shù)以其快速、準(zhǔn)確和高分辨率的特點(diǎn)，發(fā)揚(yáng)著無可替代的作用。 ?

微生物在地球上無處不在，從陸地到陸地，從衣物到皮膚，甚至我們的身體外部。

繁衍、變異、自然選擇和生活妥協(xié)，是一切生物必需閱歷的。

由于生命的*要義，是生活。

為了生活，必需妥協(xié)，生物之間為了爭(zhēng)奪資源，以及生物與自然環(huán)境之間，都存在著妥協(xié) ，在這個(gè)進(jìn)程中，有些微生物可以與人類戰(zhàn)爭(zhēng)共處，甚至互利共生，而有的微生物則會(huì)使人患病，通常有細(xì)菌、真菌、病毒、支原體，以及衣原體，這些就是臨床上的病原微生物。

自然選擇需求閱歷漫長(zhǎng)的進(jìn)程，但是近年來環(huán)境污染，藥物濫用，加快了病原微生物的退化速度，耐藥菌，超級(jí)菌的出現(xiàn)，嚴(yán)重要挾著人類安康。

還有一些微生物，原本與人類沒有交集，原先只存在于自然界，而有人為了獵奇，食用野生植物，從而把這些植物身上攜帶的病毒帶到了人類社會(huì)，如本世紀(jì)初的非典病毒（Severe Acute Respiratory Syndromes, SARS）就是例子，這類新型病毒對(duì)公共衛(wèi)生安康構(gòu)成了龐大的應(yīng)戰(zhàn)，一般人的貪心，給全世界的人們帶來了龐大的災(zāi)難。

當(dāng)安康遭到了要挾，對(duì)付細(xì)菌，人類發(fā)明了抗生素， 對(duì)付病毒，發(fā)明了抗病毒藥物，但要如何治療，*步是找出元兇，而這在臨床上往往存在困難。

傳統(tǒng)的血慣例，或許器官和組織的影像學(xué)目的可以判別感染的能夠性，但并不能作為確診的依據(jù)，比如血慣例只能通知你能否有細(xì)菌或病毒感染，但不能通知你是什么細(xì)菌或病毒，還需求進(jìn)一步反省才干確診，以便有的放矢。

實(shí)驗(yàn)室反省，如抗原檢測(cè)、核酸檢測(cè)、代謝產(chǎn)物檢測(cè)以及毒素檢測(cè)才是明白感染、指點(diǎn)治療和判別預(yù)后的重要手腕。

• 細(xì)菌和真菌檢測(cè)。通常需求先停止分別培育，再結(jié)合生化反響停止鑒定，并進(jìn)一步停止藥物敏理性實(shí)驗(yàn)，這種形式是臨床微生物實(shí)驗(yàn)室習(xí)用的經(jīng)典形式，為臨床處置了很多關(guān)鍵效果，但是其周期長(zhǎng)、陽性率低、通量高等弊端往往難以滿足臨床日益增長(zhǎng)的需求。
• 病毒、支原體、衣原體檢測(cè)。難以像細(xì)菌一樣停止分別培育，通常采用分子生物學(xué)方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒错懀≒olymerase Chain Reaction, PCR）測(cè)定核酸，靈敏快速，但只限于已知病原體的檢測(cè)，且檢測(cè)結(jié)果提供的信息相對(duì)有限，難以處置由變異帶來的醫(yī)學(xué)效果。

為了克制傳統(tǒng)方法的缺乏，下一代測(cè)序技術(shù)（Next-generation sequencing technology，NGS）在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用具有十分大的優(yōu)勢(shì)，如：

• 通量大，一次可檢測(cè)成百上千個(gè)物種，特別是未知的病原，測(cè)定其核酸序列是必不可少的手腕；
• 直接測(cè)定病原微生物的核酸序列，能為臨床提供準(zhǔn)確的診斷依據(jù)，如物種鑒定、分型以及耐藥突變等；
• 更低的檢測(cè)限，即使病原微生物的豐度很低，也可以檢測(cè)到。

當(dāng)然，NGS的缺陷也是有的：

• 相關(guān)于PCR，時(shí)效性處于優(yōu)勢(shì)；
• 本錢較高，暫時(shí)不會(huì)完全取代現(xiàn)行的慣例鑒定手腕。

即使有缺乏，但NGS的技術(shù)優(yōu)勢(shì)更為清楚，在疑問微生物，以及難以培育甚至無法分別培育的少見菌屬的鑒定，特別是新型病原微生物的爆發(fā)盛行監(jiān)測(cè)方面，NGS快速、準(zhǔn)確和高分辨率的特點(diǎn)，使其成為病毒鑒定的金規(guī)范，在盛行病學(xué)分型中發(fā)揚(yáng)著重要作用。

新型冠狀病毒（Corona Virus Disease 2019, COVID-19）正暴虐全球，目前尚無疫苗和*藥，人們除了戴口罩，留意團(tuán)體衛(wèi)生以及添加社交距離外別無他法，面對(duì)洶涌的疫情，再一次提示人類，要放下自己是萬物之靈的高傲，由于微生物才是當(dāng)之無愧的地球*，它們?cè)谶@個(gè)星球上生活的歷史比人類更長(zhǎng)，種類和數(shù)量也比人類要多得多。

我們不能，也不應(yīng)該試圖消滅一切微生物。我們之間的關(guān)系，不只要對(duì)立，還有協(xié)作，但是當(dāng)我們的安康遭到要挾時(shí)，也要勇于妥協(xié)。

物競(jìng)天擇，適者生活，人類與微生物的協(xié)作與妥協(xié)，必將永遠(yuǎn)停止下去。