Epha4敲除大鼠模型
討論與結(jié)論
Epha4是最近發(fā)現(xiàn)的肌萎縮側(cè)索硬化（漸凍癥，ALS）的致病基因，目前關(guān)于Epha4的研究主要集中在其神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育階段中所扮演的角色。然而，Epha4在不同組織器官中均廣泛表達，而關(guān)于Epha4在其他組織中的作用卻鮮有報道。
目前Epha4基因敲除動物模型多為小鼠。研究報道基因敲除的小鼠具有共濟失調(diào)、袋鼠步態(tài)等表型。而我們建立的Epha4基因敲除大鼠除觀察到以上表型外，還發(fā)現(xiàn)其生存率下降。且該模型因為在Epha4基因的啟動子后插入了報告基因mCherry，可以觀察到Epha4基因在不同組織器官的表達模式。該模型大鼠為探究Epha4在各組織器官中的病理生理作用提供了實驗條件。
由于觀察到Epha4基因在心臟中的差異性表達——在心臟中的分布主要集中在心房部位，所以我們推測Epha4基因?qū)π姆康慕Y(jié)構(gòu)功能產(chǎn)生影響。我們進一步檢測了心臟功能，并發(fā)現(xiàn)心臟功能，尤其是心房功能出現(xiàn)明顯改變。我們觀察到Epha4基因敲除大鼠心房明顯擴大，心房射血分數(shù)顯著下降，且心電出現(xiàn)明顯異常。所以Epha4可能對心房發(fā)育過程產(chǎn)生影響。因此，本基因敲除大鼠模型也可作為研究心房發(fā)育或心電異常的動物模型，為探究Epha4在心房發(fā)育及心電傳導(dǎo)中的作用提供實驗條件。
生物安全性
SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012-001】。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18003.
評價驗證
4.1 Epha4敲除大鼠模型的建立
通過PCR方法進行基因型鑒定Epha4敲除大鼠基因型。免疫印跡Westernblot方法鑒定Epha4-/-大鼠epha4蛋白的敲除（圖2）。
圖2 Epha4敲除大鼠模型基因型鑒定及基因蛋白表達水平鑒定
4.2 Epha4敲除大鼠生存率分析
對Epha4-/-基因型和WT野生型進行生存率分析顯示，WT生存正常，生存率為100%，Epha4-/-生存率下降（圖3）。
圖3 Epha4敲除大鼠生存率分析
4.3 Epha4敲除大鼠心臟重量/體重比分析
對WT和Epha4-/-進行大體形態(tài)觀察并計算心臟重量與體重之比（heart weight/body weight，HW/BW）。實驗結(jié)果，與野生型相比，2、6、9月齡Epha4-/-大鼠心臟/體重比均無明顯變化（圖4）。2M WT大鼠HW/BW平均值±標準差為0.38 ± 0.035（%），KO大鼠0.393 ± 0.052（%）；6M WT大鼠HW/BW平均值±標準差為0.352 ± 0.024（%），KO大鼠0.0.369 ± 0.035（%）；9M WT大鼠HW/BW平均值±標準差為0.311 ± 0.043（%），KO大鼠0.338± 0.047（%）。從形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，Epha-/-大鼠的心房與野生大鼠相比明顯增大，計算心房重量與心臟重量比值（atrium weight/body weight,AW/HW）。實驗結(jié)果顯示，與WT相比，Epha4-/-右心房/心臟重量比顯著增加，2M WT大鼠右心房AW/HW平均值±標準差為5.939 ± 1.192（%），KO大鼠為7.112 ± 1.283（%）；6M WT大鼠右心房AW/HW平均值±標準差為4.655 ± 0.541（%），KO大鼠為6.892 ± 0.857（%），有顯著性差異（圖5，*P<0.05）；9M WT大鼠右心房AW/HW平均值±標準差為4.72± 0.936（%），KO大鼠為7.478± 0.681（%），差異非常顯著（圖5，**P<0.01）。圖 4 Epha4敲除大鼠HW/BW比率分析
圖 5 Epha4敲除大鼠AW/HW比率分析
4.4 M型超聲心動圖檢測Epha4敲除大鼠心臟的結(jié)構(gòu)和功能
為分析心臟結(jié)構(gòu)與功能狀態(tài)改變，本研究通過M型超聲心動圖檢測1、2、6、9四個月齡野生和敲除大鼠心臟的結(jié)構(gòu)和功能。發(fā)現(xiàn)與同窩WT大鼠相比，自2M起，Epha4-/-大鼠射血分數(shù)明顯下降，差異顯著（圖6，*P<0.05，**P<0.01），而左心室內(nèi)徑、室壁均無明顯變化（圖6）。
圖6 Epha4敲除大鼠左心室結(jié)構(gòu)功能分析
注：射血分數(shù)（ejection fraction，EF）；舒張期左心室前壁厚度（left ventricular anterior wall; diastolic，LVAW;d）；左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVID;d）；、。*P<0.05，**P<0.01，versus同窩WT大鼠。
4.5磁共振成像分析Epha4敲除大鼠心房結(jié)構(gòu)和功能
為進一步分析Epha4敲除大鼠心房的結(jié)構(gòu)和功能，本研究通過核磁分析2、6、9月齡WT和Epha4敲除大鼠左右心房容積和射血分數(shù)。結(jié)果表明，與WT大鼠相比，Epha4敲除大鼠左右心房容積均無明顯變化。但6、9月齡敲除大鼠心房射血分數(shù)與野生大鼠相比明顯下降，6M組WT左房射血分數(shù)為69.763±9.918（%），KO左房射血分數(shù)為47.35±7.458（%）；WT右房射血分數(shù)為69.123±14.592（%），KO右房射血分數(shù)為39.67±7.653（%）。9M組WT左房射血分數(shù)為52.738±10.739（%），KO左房射血分數(shù)為46.637±4.487（%）；WT右房射血分數(shù)為56.978±14.281（%），KO右房射血分數(shù)為32.967±2.492（%）（圖7）。
圖 7 Epha4敲除大鼠左右心房結(jié)構(gòu)功能分析
4.6心電分析Epha4敲除大鼠心傳導(dǎo)功能
從上面的結(jié)果我們已知，心房的改變發(fā)生在心室改變之前，為了進一步分析心房的電傳導(dǎo)功能，我們對WT和Epha4敲除大鼠進行了心電圖記錄。結(jié)果顯示，自1M起，敲除大鼠的心電出現(xiàn)了明顯的改變，p波消失（圖8），QRS波峰值增高，QT間期延長（圖9，**P<0.01）。
圖 8 Epha4敲除大鼠心電圖記錄
圖 9 Epha4敲除大鼠心電指標分析
制備方法
3.1 實驗材料
3.1.1 實驗動物
SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012-001】。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18003.
3.1.2實驗儀器
3.1.3實驗試劑
3.1.4 模型構(gòu)建流程在Epha4基因的啟動子后插入一個報告基因mCherry，造成移碼突變，實現(xiàn)基因敲除，制備Epha4基因敲除大鼠，并使用PCR方法進行基因型鑒定，使用Western blot技術(shù)進行敲除效率的鑒定。3.1.5 Epha4敲除大鼠的建立3.1.5. 1 Epha4敲除大鼠模型的建立(1) 設(shè)計方案
(2) 構(gòu)建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expressionvector，根據(jù)基因信息選擇靶點并合成sgRNA。
靶點1:
CCA GCCTCCGGAGACCTTGAG
R-EPHA4-gRNAUP1 5’TAGGCTCAAGGTCTCCGGAGGC
R-EPHA4-gRNADOWN1 5’AAACGCCTCCGGAGACCTTGAG
靶點2:
CCC GGCGAATGAAGGTAAGAG
R-EPHA4-gRNAUP2 5’TAGGCTCTTACCTTCATTCGCC
R-EPHA4-gRNADOWN2 5’AAACGGCGAATGAAGGTAAGAG
(3) 合成的sgRNA單鏈通過退火復(fù)性結(jié)合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構(gòu)建完成的sgRNA載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA。
(4) 構(gòu)建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的Cas9-RNA。
(5) 顯微注射
1) 超數(shù)排卵：15只3-4周齡SD雌鼠注射激素進行超排。
2) 受精卵注射：取約150枚受精卵進行注射。
3) 雄鼠結(jié)扎：制作30只8周齡輸精管結(jié)扎的SD雄鼠。
4) 受體鼠制備：8-10周齡SD雌鼠與結(jié)扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。
5) 胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，150枚卵，5只受體鼠）。
(6) 基因型鑒定
1) 剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進行編號及取材。
2) 基因組DNA提取：使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA
3) PCR檢測：根據(jù)序列信息設(shè)計檢測引物并進行PCR檢測。
(7) 結(jié)果分析：選取通過PCR檢測后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號，將PCR產(chǎn)物進行TA克隆，之后用檢測引物進行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。
(8) 根據(jù)測序結(jié)果確定Epha4敲除模型大鼠（SD.Epha4(tm-mCherry)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后續(xù)實驗。
3.1.5.2 Epha4敲除大鼠的建立
根據(jù)3.1.5.1獲得Epha4-/-大鼠F1代后，首先通過8周齡左右Epha4-/-與野生型大鼠進行雜交，獲得一定數(shù)量的Epha4+/-大鼠。之后使8周齡左右Epha4+/-大鼠進行第二輪雜交，可得到Epha4-/-大鼠，用于后續(xù)實驗。
3.1.5.3 鼠尾基因組DNA提取
在幼崽出生后剪腳趾標記，收集幼崽腳趾至1.5 mL EP管。然后參照DNA提取試劑盒說明書按以下程序操作。
(1) 加入100μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃搖床孵育至完全裂解。
(2) 12000rpm 離心5min，轉(zhuǎn)移上清于一無菌的離心管中。
(3) 加入500μLBB2，立即渦旋5s，室溫孵育10min。
(4) 將全部的溶液加入離心柱中，8000rpm離心1min，棄掉流出液。
(5) 加入500μL CB2溶液，12000 rpm離心1min，棄掉流出液。
(6) 重復(fù)步驟（5）一次。
(7) 加入500μL WB2（使用前加入88 mL無水乙醇），12000rpm 離心1min，棄掉流出液。
(8) 重復(fù)步驟（7）一次。
(9) 10000rpm 離心2min，徹底去除殘留的WB2。
(10) 將離心柱置于一干凈的離心管中，開蓋靜置5min，在柱的中央加入50~200μL預(yù)熱EB（60℃~70℃），蓋上蓋子，室溫靜置3min，12000rpm 離心2min，洗脫DNA。保存至4℃冰箱。
研究背景
一、疾病概述
心律失常（arrhythmia）是由于竇房結(jié)激動異?；蚣赢a(chǎn)生于竇房結(jié)以外，激動的傳導(dǎo)緩慢、阻滯或經(jīng)異常通道傳導(dǎo)，即心臟活動的起源和（或）傳導(dǎo)障礙導(dǎo)致心臟搏動的頻率和（或）節(jié)律異常。心律失常是心血管疾病中重要的一組疾病。它可單獨發(fā)病，亦可與其他心血管病伴發(fā)。其預(yù)后與心律失常的病因、誘因、演變趨勢、是否導(dǎo)致嚴重血流動力障礙有關(guān)，可突然發(fā)作而致猝死，亦可持續(xù)累及心臟而致其衰竭。
遺傳性心律失常多為基因通道突變所致，如長QT綜合征、短QT綜合征、Brugada綜合征等。后天獲得性心律失?？梢娪诟鞣N器質(zhì)性心臟病，其中以冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心肌病、心肌炎和風濕性心臟病多見，尤其在發(fā)生心力衰竭或急性心肌梗死時。另有發(fā)生在基本健康者或植物神經(jīng)功能失調(diào)患者中的心律失常。其他病因包括電解質(zhì)或內(nèi)分泌失調(diào)，麻醉，低溫，胸腔或心臟手術(shù)，藥物作用和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，部分病因不明。
二、模型背景
1、造模因素信息
Epha4，Ephreceptor A4 [Rattus norvegicus]，Gene ID：316539。
2、實驗動物背景信息
SD大鼠
3、研究背景
受體酪氨酸激酶（receptortyrosine kinases, RTKs）可使外界刺激信息傳遞至細胞核，參與細胞生長、增殖、轉(zhuǎn)化及胚胎發(fā)育等重要生理過程。Eph家族(包括Eph受體和ephrin配體)是最大的RTK亞族。Eph受體是一種膜結(jié)合的Ⅰ型糖蛋白,其結(jié)構(gòu)分為胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)及跨膜區(qū)，其胞外區(qū)包括一個IgG樣球形結(jié)構(gòu)域。作為一大類新發(fā)現(xiàn)的RTK，Eph家族廣泛的種屬和組織分布，結(jié)構(gòu)上的高度保守，提示它們在細胞內(nèi)具有重要的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，Eph家族不僅在胚胎神經(jīng)、脈管系統(tǒng)的發(fā)育和分化中發(fā)揮作用，而且參與不同組織和細胞間多條通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及免疫功能的調(diào)節(jié)；另外，其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程也密切相關(guān)1,2。有關(guān)Eph的研究尚處于資料和認識的積累階段；克隆Eph亞族新基因，繼續(xù)探索各成員的天然配體、特異底物范圍及生理功能仍然是目前研究的熱點。
根據(jù)基因結(jié)構(gòu)、堿基序列同源性、表達分布及結(jié)合配體的不同，Eph受體被分為EphA（A1-A8，A10）和EphB（B1-B4，B6）兩個亞家族，其相應(yīng)配體被命名為ephrin，根據(jù)結(jié)合方式也分為Ａ、Ｂ兩類ephrinA（A1-A5）與ephrinB（B1-B3）3,4。一般認為EphA的配體是ephrinA，EphB的配體是ephrinB，但是研究發(fā)現(xiàn)Epha4既可以結(jié)合ephrinA也可結(jié)合ephrinB5。
Epha4與配體結(jié)合后，可以激活其下游NCK、RAS、Src、PDZ等信號，參與細胞生長、運動、凋亡及癌變等重要生理病理過程6-9。目前關(guān)于Epha4的研究主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程。在發(fā)育早期，Epha4在中樞神經(jīng)的發(fā)育過程中高表達，與菱腦發(fā)育和形態(tài)形成關(guān)系密切；在成年階段，Epha4被證實與突觸可塑性和興奮毒性有關(guān)，同時它還是肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophiclateral sclerosis，ALS）的重要修飾基因3,10, 11。然而，Epha4的表達不僅限于神經(jīng)系統(tǒng)；根據(jù)表達譜，在人體多種組織中，Epha4均有不同程度表達。最新研究表明，Epha4與多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺導(dǎo)管癌等多種腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等過程有關(guān)12-19；另外，Epha4還參與胰高血糖素分泌、破骨細胞活性調(diào)控、單核細胞在血管上皮粘附、先天性腎盂積水以及胸腺發(fā)育等生理或病理過程20-23（表1），預(yù)示著Epha4在非神經(jīng)組織中也應(yīng)具有重要作用。
目前的研究多采用基因敲除小鼠作為Epha4基因功能研究的動物模型。研究發(fā)現(xiàn)，基因敲除小鼠表現(xiàn)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常、跳躍的“袋鼠式”步態(tài)，同時還出現(xiàn)腎組織損傷、胸腺發(fā)育異常等20,21, 24, 25。但關(guān)于Epha4對其他非神經(jīng)組織的影響未見報道。
參考文獻：
1. Rudno-Rudzinska J, Kielan W, Frejlich E, et al. A review onEph/ephrin, angiogenesis and lymphangiogenesis in gastric, colorectal andpancreatic cancers. Chinese journal of cancer research = Chung-kuo yen chengyen chiu. Aug 2017;29(4):303-312.
2. Kania A, Klein R. Mechanisms of ephrin-Eph signalling indevelopment, physiology and disease. Nature reviews Molecular cell biology. Apr2016;17(4):240-256.
3. Xu Q, Mellitzer G, Wilkinson DG. Roles of Eph receptors andephrins in segmental patterning. Philosophical transactions of the RoyalSociety of London Series B, Biological sciences. Jul 292000;355(1399):993-1002.
4. Katoh M, Katoh M. Comparative integromics on Eph family.International journal of oncology. May 2006;28(5):1243-1247.
5. Gale NW, Holland SJ, Valenzuela DM, et al. Eph receptors andligands comprise two major specificity subclasses and are reciprocallycompartmentalized during embryogenesis. Neuron. Jul 1996;17(1):9-19.
6. Bisson N, Poitras L, Mikryukov A, Tremblay M, Moss T. Epha4signaling regulates blastomere adhesion in the Xenopus embryo by recruitingPak1 to suppress Cdc42 function. Molecular biology of the cell. Mar2007;18(3):1030-1043.
7. Shin J, Gu C, Kim J, Park S. Transient activation of the MAPkinase signaling pathway by the forward signaling of Epha4 in PC12 cells. BMBreports. Jun 30 2008;41(6):479-484.
8. Richter M, Murai KK, Bourgin C, Pak DT, Pasquale B. The Epha4receptor regulates neuronal morphology through SPAR-mediated inactivation ofRap GTPases. The Journal of neuroscience : the official journal of the Societyfor Neuroscience. Dec 19 2007;27(51):14205-14215.
9. Bourgin C, Murai KK, Richter M, Pasquale EB. The Epha4 receptorregulates dendritic spine remodeling by affecting beta1-integrin signalingpathways. The Journal of cell biology. Sep 24 2007;178(7):1295-1307.
10. Fu AK, Hung KW, Fu WY, et al. APC(Cdh1) mediates Epha4-dependentdownregulation of AMPA receptors in homeostatic plasticity. Natureneuroscience. Feb 2011;14(2):181-189.
11. Van Hoecke A, Schoonaert L, Lemmens R, et al. EPHA4 is a diseasemodifier of amyotrophic lateral sclerosis in animal models and in humans.Nature medicine. Sep 2012;18(9):1418-1422.
12. de Marcondes PG, Bastos LG, de-Freitas-Junior JC, Rocha MR,Morgado-Diaz JA. Epha4-mediated signaling regulates the aggressive phenotype ofirradiation survivor colorectal cancer cells. Tumour biology : the journal ofthe International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine. Sep2016;37(9):12411-12422.
13. Efazat G, Novak M, Kaminskyy VO, et al. Ephrin B3 interacts with multipleEphA receptors and drives migration and invasion in non-small cell lung cancer.Oncotarget. Sep 13 2016;7(37):60332-60347.
14. Hachim IY, Villatoro M, Canaff L, et al. Transforming GrowthFactor-beta Regulation of Ephrin Type-A Receptor 4 Signaling in Breast CancerCellular Migration. Scientific reports. Nov 03 2017;7(1):14976.
15. Lin CY, Lee YE, Tian YF, et al. High Expression of Epha4 PredictedLesser Degree of Tumor Regression after Neoadjuvant Chemoradiotherapy in RectalCancer. Journal of Cancer. 2017;8(6):1089-1096.
16. Royet A, Broutier L, Coissieux MM, et al. Ephrin-B3 supportsglioblastoma growth by inhibiting apoptosis induced by the dependence receptorEpha4. Oncotarget. Apr 04 2017;8(14):23750-23759.
17. Ding L, Shen Y, Ni J, Ou Y, Ou Y, Liu H. Epha4 promotes cellproliferation and cell adhesion-mediated drug resistance via the AKT pathway inmultiple myeloma. Tumour biology : the journal of the International Society forOncodevelopmental Biology and Medicine. Mar 2017;39(3):1010428317694298.
18. Allina DO, Andreeva YY, Zavalishina LE, Moskvina LV, Frank GA.[Estimation of the diagnostic potential of APOD, PTOV1, and EPHA4 for prostaticneoplasms]. Arkhiv patologii. 2016;78(5):9-14.
19. Liu C, Huang H, Wang C, Kong Y, Zhang H. Involvement of ephrinreceptor A4 in pancreatic cancer cell motility and invasion. Oncology letters.Jun 2014;7(6):2165-2169.
20. Sallstrom J, Peuckert C, Gao X, et al. Impaired Epha4 signalingleads to congenital hydronephrosis, renal injury, and hypertension. Americanjournal of physiology Renal physiology. Jul 01 2013;305(1):F71-79.
21. Munoz JJ, Alfaro D, Garcia-Ceca J, Alonso CL, Jimenez E, Zapata A.Thymic alterations in Epha4-deficient mice. Journal of immunology (Baltimore,Md : 1950). Jul 15 2006;177(2):804-813.
22. Hutchens T, Piston DW. Epha4 Receptor Forward Signaling InhibitsGlucagon Secretion From alpha-Cells. Diabetes. Nov 2015;64(11):3839-3851.
23. Stiffel V, Amoui M, Sheng MH, Mohan S, Lau KH. Epha4 receptor is anovel negative regulator of osteoclast activity. Journal of bone and mineralresearch : the official journal of the American Society for Bone and MineralResearch. Apr 2014;29(4):804-819.
24. Dottori M, Hartley L, Galea M, et al. Epha4 (Sek1) receptortyrosine kinase is required for the development of the corticospinal tract.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica. Oct 27 1998;95(22):13248-13253.
25. Leighton PA, Mitchell KJ, Goodrich LV, et al. Defining brainwiring patterns and mechanisms through gene trapping in mice. Nature. Mar 082001;410(6825):174-179.
模型信息
中文名稱:Epha4敲除大鼠模型
英文名稱:SD.Epha4(tm-mCherry)-GC/ILAS
類型:心律失常動物模型
分級:NA
用途:本基因敲除大鼠模型也可作為研究心房發(fā)育或心電異常的動物模型，為探究Epha4在心房發(fā)育及心電傳導(dǎo)中的作用提供實驗條件。
研制單位:中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所
保存單位:中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所
