Lep基因缺失導(dǎo)致小鼠自發(fā)性肥胖，基因敲除的純合子小鼠具有肥胖、嗜食、活性低、代謝效率高、產(chǎn)熱受損、不孕和壽命短等表型，體重達(dá)到正常小鼠的三倍，影響糖尿病的嚴(yán)重程度和病程。與高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖(DIO)小鼠相比，Lep基因敲除小鼠表現(xiàn)出不受調(diào)節(jié)的進(jìn)食(貪食)，這導(dǎo)致肥胖、糖尿病和比DIO小鼠癥狀更為嚴(yán)重的疾病。

模型動(dòng)物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物房SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點(diǎn)

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時(shí)針走向設(shè)計(jì)。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機(jī)房和配電室等。

（2）設(shè)計(jì)參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對(duì)濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強(qiáng)梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級(jí)；菌落數(shù)：≤3個(gè)/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動(dòng)物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時(shí)間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)?？諝饨?jīng)過初、中、三級(jí)過濾器后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動(dòng)物飼養(yǎng)室、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實(shí)驗(yàn)室等安裝有手動(dòng)和自動(dòng)開關(guān)，根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點(diǎn)和晚上8點(diǎn)開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因?yàn)镾PF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進(jìn)入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話機(jī)，按照房間順序編排電話號(hào)碼，各室內(nèi)電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機(jī)保持聯(lián)系，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外信息的及時(shí)溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的出入口、走道、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機(jī)，能夠及時(shí)了解設(shè)施的運(yùn)行狀態(tài)；也能有效督促實(shí)驗(yàn)人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的動(dòng)物狀態(tài)和反應(yīng)進(jìn)行觀察，減少對(duì)動(dòng)物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水以純凈水為宜。本實(shí)驗(yàn)室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報(bào)系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動(dòng)物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室使用獨(dú)立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機(jī)房控制室安裝風(fēng)機(jī)故障警報(bào)系統(tǒng)，以便及時(shí)檢修和維護(hù)，保證設(shè)施的安全運(yùn)行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進(jìn)入SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室時(shí)所攜帶的細(xì)菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動(dòng)物交叉感染，按照不同物品的特性，進(jìn)行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C(jī)動(dòng)門真空滅菌器消毒。

（10）動(dòng)物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn)。通用的不銹鋼籠具長(zhǎng)、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，配有底盤和食槽，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有充足的采食和活動(dòng)空間，同時(shí)也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時(shí)，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測(cè)一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

全身性lep基因敲除小鼠采用PCR方式進(jìn)行鑒定。

（1）引物信息：見表4

（2）PCR結(jié)果：見圖1-5#、7-10#小鼠PCR結(jié)果符合要求，需進(jìn)一步測(cè)序鑒定。

圖2. F/R 檢測(cè)Lep基因刪除情況

（3）測(cè)序結(jié)果：通過峰形分析，可以將突變型的DNA 序列（紅色箭頭所指峰形）分析出來。結(jié)果為AGGAGGGGCCAGCC 前的缺失約3162bp,發(fā)生片段敲除。具體見圖3。說明全身性Lep基因敲除小鼠構(gòu)建成功。

模型背景：C57BL/6J小鼠

模型制作方法：

（1）根據(jù)Lep 的基因組序列結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)CRISPR 靶點(diǎn)：

根據(jù)目前基因組數(shù)據(jù)，Lep 基因存在2 個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，見下圖：

http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000059201;r=6:29060220-29073877

Lep 保守區(qū)域分析：

根據(jù)Lep 基因組結(jié)構(gòu)和蛋白功能保守區(qū)，Lep 有2 個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。選取Lep-201進(jìn)行設(shè)計(jì)，Exon2-3(aa1-167)，為編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的外顯子,而且也是Lep 基因所有轉(zhuǎn)錄本Lep-202 的全部的外顯子序列，刪除這Exon2-3 后，翻譯該蛋白的mRNA 將不會(huì)被轉(zhuǎn)錄出來，而且該基因被完全敲除。因此決定在Exon2-3 的兩邊設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)Exon2-3 敲除。

下面將根據(jù)Exon8 設(shè)計(jì)條件性敲除方案。

轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物L(fēng)ep-201 的基因組結(jié)構(gòu)：

（2）F0 代構(gòu)建及繁殖：

基因敲除構(gòu)建設(shè)計(jì)。

肥胖是指身體超重，脂肪異常堆積的狀態(tài)。肥胖與多種疾病有關(guān)，如糖尿病、某些癌癥、高血壓和心血管疾病。肥胖一直被認(rèn)為是由個(gè)人習(xí)慣造成的，主要是熱量攝入過多和缺乏鍛煉。此外，遺傳成分，如遺傳缺陷和遺傳變異，包括瘦素基因突變，也可能對(duì)超重和肥胖的發(fā)展有強(qiáng)大的作用等。瘦蛋白是一種由白色脂肪細(xì)胞、骨骼肌、胎盤和垂體等組織產(chǎn)生的激素，主要由脂肪組織分泌；影響下丘腦，調(diào)節(jié)食欲和能量平衡，從而導(dǎo)致體重增加。同時(shí)，瘦蛋白對(duì)于維持垂體GH細(xì)胞及其功能也很重要。當(dāng)促生長(zhǎng)激素細(xì)胞的瘦蛋白受體發(fā)生缺失，則導(dǎo)致GH細(xì)胞數(shù)量減少、循環(huán)生長(zhǎng)激素減少，最終引起成體性肥胖。Lep基因缺失導(dǎo)致小鼠自發(fā)性肥胖，基因敲除的純合子小鼠具有肥胖、嗜食、活性低、代謝效率高、產(chǎn)熱受損、不孕和壽命短等表型，體重達(dá)到正常小鼠的三倍，影響糖尿病的嚴(yán)重程度和病程。與高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖(DIO)小鼠相比，Lep基因敲除小鼠表現(xiàn)出不受調(diào)節(jié)的進(jìn)食(貪食)，這導(dǎo)致肥胖、糖尿病和比DIO小鼠癥狀更為嚴(yán)重的疾病。