1.評價指標體系

1）DAI評分

分值

0

1

2

3

4

體重變化

＞99%

95%-99%

90%-95%

85%-90%

＜85%

糞便形態(tài)

正常

軟便

便不成型

稀便

粘液或水樣便

便血情況

無便血

/

隱血

/

便血

2）生化指標：

（1）炎性因子測定：IL-6、IL-1β、TNF-α

（2）HE染色：以結腸細胞排列、炎癥浸潤情況、空腔數(shù)作為動物結腸損傷的評價指標，細胞排列整齊、炎癥浸潤、空腔少表明損傷越小。

2. 國內外現(xiàn)有模型的異同

截止目前為止，國內外文獻中已報道的造成炎癥性腸病動物模型的方法有：化學誘導、免疫和炎癥、大腸桿菌誘導等單一因素或多種因素誘導的方法構建的一系列用于炎癥性腸病研究的動物模型。

而在這些方法中，化學誘導是最為常用的造成炎癥性腸病的方法，如飲用DSS、TNBS灌腸、惡唑酮皮膚表面滴注及灌腸等。如：I Okayasu等對小鼠予飲用水中添加一定分子量的DSS，就可導致不同程度的炎癥性腸病模型[2]；取4%~10%的乙酸1.5 mL灌入大鼠結腸內5~8 cm處，10~20 s后用0.9%氯化鈉3~5 mL沖洗1次[3]；取一定量的OXZ乙醇溶液一次性經(jīng)導管(距肛4 cm)灌注入結腸內[4]；用降解的1%角叉菜膠水溶液飼喂動物,數(shù)周后實驗動物可導致UC。[5]；基因敲除和轉基因誘導炎癥性腸病模型[6]。盡管這些誘導方法能夠模擬當今人們的病理狀態(tài)，但因考慮因素多、操作復雜，不易控制，病變自愈能力不同、維持時間不一，重復性差，死亡率高等，造模參數(shù)各異。

3. 技術難點

（1）硅膠管或聚乙烯導管的選擇。本實驗室采用硅膠管或聚乙烯導管，長度為12cm，內徑為2mm。既保證了能夠伸入到大鼠結腸部位，又能保證不會對大鼠結腸造成另外物理傷害。為造模成功提供了基礎。

（2）造模時長的選擇。綜合了前期文獻調研和本實驗室的實驗基礎，采用造模兩次刺激，保證造模液完全被腸腔吸收，而非隨糞便排除。

（3）糞便隱血檢測評分。以空白組顏色以及改變時間做對照。

4. 創(chuàng)新性

（1）造模兩次刺激，保證造模液完全被腸腔吸收，而非隨糞便排除。 可以建立更穩(wěn)定、更有效的動物疲勞模型。

（2）揭示了炎癥性腸病與PPAR γ 有關。PPAR γ 參與炎癥及免疫反應的調節(jié)，在炎癥反應中發(fā)揮抗炎的作用。

5. 應用價值

采用TNBS乙醇溶液灌腸的方法，對動物麻醉后進行灌腸而造成炎癥性腸病，能夠很好模擬當今社會人們所處的工作環(huán)境、生活狀態(tài)等因素而引起的炎癥性腸病：如生活方式生活習慣的改變、腹痛腹瀉、腸道菌群紊亂、免疫持續(xù)激活以及工作和生活所帶來的生理和心理壓力等等。因此，該模型為緩解IBD腹痛腹瀉、便血的功效評價提供了一個已操作、穩(wěn)定可控的動物模型。

動物飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所的屏障環(huán)境，12 h 照明/12 h 黑暗( 照明: 8: 00-20:00) ，飼養(yǎng)期間給予動物標準飼料和潔凈飲水。本動物實驗遵守國際實驗動物倫理學要求。

（一）TNBS乙醇灌腸致大鼠炎癥性腸病的分子機制

1實驗材料 1.1試劑耗材

TRIzol（Solarbio, China）；磷酸酶抑制劑（CWBIO, China）；蛋白酶抑制劑（CWBIO, China）；RIPA裂解液（Solarbio, China）；BCA 蛋白質檢測試劑盒（Solarbio, China）；廣譜彩虹預染蛋白Maker（CWBIO, China）；T-bet、RORy t、Foxp 3

1.2實驗儀器

超聲破碎儀（Sonics, USA）、小型垂直電泳儀（Bio-Rad, USA）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad, USA）。

2實驗方法 2.1動物實驗及取材方法

動物實驗及過程如前所述。

2.2轉錄組學分析

使用TRIzol（Solarbio, China）從對照組和IBD大鼠中提取總RNA，進行轉錄組學分析。使用NanoDrop和Agilent 2100對RNA質量進行評估，然后使用Illumina測序平臺（HiSeqTM4000）對RNA進行測序。通過HTSeq對各基因表達水平進行分析，然后從負二項分布檢驗得到p值，并使用FDR (BH)進行調整。差異表達基因(DEGs)篩選的標準為p值小于0.05。

2.3蛋白質印跡分析

將大鼠結腸組織勻漿，并在含有 1% 磷酸酶和蛋白酶抑制劑混合物（CWBIO, China）的RIPA（Solarbio, China）中裂解。使用 BCA 蛋白質檢測試劑盒（Solarbio, China）對勻漿中的蛋白質濃度進行定量，并調整至相同濃度。將蛋白在100℃水浴中加熱5 min使蛋白變性，并保存與-80℃。

上樣25-50 ug 變性蛋白質和3 ul廣譜彩虹預染蛋白Maker（CWBIO, China）進行電泳。之后轉膜至硝酸纖維素膜（0.2 μm）上。膜在5%脫脂牛奶中封閉1.5小時，并在4℃下孵育特異性一抗過夜。隨后，在室溫下孵育二抗（CWBIO, China）1.5 h（山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG H&L，在1：5000稀釋）。使用增強的化學發(fā)光方法在凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad, USA）中曝光，使蛋白質表達可視化。最后將蛋白條帶強度與相應的總蛋白或 GAPDH比進行標準化。

2.4組織病理和免疫組織化學分析

將大鼠結腸組織用4%多聚甲醛緩沖液固定24 h，然后用石蠟包埋。切下5 um厚的結腸切片，并用蘇木精和伊紅（H&E）染色。

2.5數(shù)據(jù)分析

使用 ImageJ 軟件（1.8.0, National Institutes of Health, USA）對蛋白條帶進行定量。使用t檢驗分析兩組數(shù)據(jù)之間的差異。使用單因素方差分析用于兩組以上的比較。當數(shù)據(jù)偏離正態(tài)分布時，使用非參數(shù)檢驗。使用 SPSS 25.0軟件（IBM Corp., USA）進行統(tǒng)計計算。 所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±平均值的標準誤差（SEM），以p < 0.05判斷為顯著。 使用 GraphPad Prism 7.0（USA）繪制圖形。

3實驗結果 3.1 TNBS乙醇溶液灌腸致大鼠腸上皮細胞炎癥浸潤

為了研究TNBS乙醇溶液灌腸誘導大鼠IBD發(fā)生的機制，我們對與胃腸道運動相關的結腸組織進行了研究。對TNBS乙醇溶液灌腸造模后，HE染色觀察結腸組織形態(tài)，空白對照組結腸組織切片中，黏膜上皮細胞排列整齊緊密，模型組炎性細胞嚴重浸潤，杯狀細胞缺失。上述表明，TNBS乙醇溶液灌腸造?？稍斐纱笫竽c黏膜上皮細胞出現(xiàn)破裂、炎癥介質浸潤。

3.2 IBD大鼠結腸轉錄組學研究

為了系統(tǒng)地研究TNBS乙醇溶液灌腸對大鼠結腸部位產(chǎn)生的影響，通過轉錄組測序分析了對照組和TNBS乙醇處理大鼠的結腸。在對照組與模型組中共發(fā)現(xiàn)了x個差異表達基因（DEGs）。其中模型組顯著上調了195個基因，顯著下調了44個基因(圖8a)。KEGG富集分析結果表明。。基于KEGG結果的熱圖顯示，x信號通路、基因均受到TNBS處理的顯著調控(圖8b)。GO分子功能分析表明，；細胞成分分析顯示，；并且在生物過程中也富集了許多x過程相關的代謝途徑(圖8d)。轉錄組分析結果表明，TNBS乙醇致大鼠炎癥性腸病的原因與。。有關，并與。。AMPK信號通路密切相關。

圖8 通過RNA-Seq分析TNBS乙醇對大鼠結腸基因表達的影響（mean ± SEM，n=3）。（a）結腸中x個特異性DEGs的火山圖；（b）DEGs的KEGG富集分析；（c）信號通路相關的DEGs表達熱圖; （d）DEGs的GO富集分析。

3.3 TNBS乙醇誘導IBD結腸組織炎癥、潰瘍與PPAR γ

PPAR γ 參與炎癥及免疫反應的調節(jié)，作為巨噬細胞的負調節(jié)因子，在炎癥反應中發(fā)揮抗炎的作用。PPAR γ 配體抑制免疫、炎癥反應可能與抑制 IκB 磷酸化有關。PPAR γ 激活有助于下調 Th1 細胞因子(INF-γ、 TNF-α)，上調 Th2 細胞因子(IL-4、IL-10)，調節(jié) T 細胞分化。

4小結

本研究證明了IBD大鼠的炎癥與過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR γ）有關。TNBS乙醇溶液誘導的炎癥性腸病是由于免疫激活而引起的，這主要與PPAR γ/T細胞調節(jié)有關。通過調控PPAR γ/NF-κB信號通路，釋放炎性因子，調節(jié)T細胞分化，導致炎癥性腸病發(fā)生。這些證據(jù)為治療TNBS乙醇溶液誘導炎癥性腸病提供了思路。

（二）以美沙拉嗪為陽性藥，對戊己丸治療IBD大鼠的功效進行評價驗證

1實驗材料 1.1實驗動物

SD雄性大鼠60只，6周齡，體重220-240 g，購自北京市維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：CXK（京）2021—0011、SCXK（京）2021—0006。動物購入后于SPF級動物中心飼養(yǎng)。保持飼養(yǎng)環(huán)境安靜，室溫22-25℃，濕度50%-60%，明暗交替周期12 h/12 h。整個實驗過程中大鼠可自由進食進水。

1.2實驗試劑和儀器

TNBS（sigma）；糞便隱血試劑盒（雷根生物）；戊巴比妥鈉（sigma）；炎性因子Elisa試劑盒。陽性藥“美沙拉嗪”。戊己丸（李時珍醫(yī)藥集團有限公司）

酶標儀（Thermo scientific）。

2實驗方法 2.1動物分組、造模及給藥

大鼠適應性飼養(yǎng)4天，根據(jù)體重將動物隨機分為5組，即空白對照組、模型組、陽性藥組、戊己丸低劑量組和高劑量組，每組10只。

空白對照組使用生理鹽水，其余各組均使用TNBS乙醇溶液灌腸刺激以建立大鼠IBD模型。實驗前禁食不禁水 24h，稱重，腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉；用直徑 2.0 mm 長 12 cm 的輸液管經(jīng)液體石蠟潤滑后,通過肛門輕 輕插入結腸至標記好的 8 cm 處，一次性緩慢推入新鮮配制的 TNBS 造模溶液(150 mg/kg TNBS+50%乙醇，體積比 2:1),捏緊肛門提尾倒立 1-3 min，以避免造模液 回流，同時輕揉鼠腹，保持動物臀部高于腹部 15 min。最后，使大鼠側臥，放回 籠中自然蘇醒,之后常規(guī)飼養(yǎng)。

造模造模 24h 后給藥，陽性藥物組和戊己丸各劑量組灌胃相應劑量的藥物，空白對照組、模型組灌胃等量飲用水，給藥x天后，進行檢測。

3實驗結果 3.1戊己丸對IBD大鼠體重的影響

結果如圖所示，與空白對照組相比，模型組大鼠在TNBS乙醇溶液處理后模型大鼠精神狀態(tài)萎靡不振，在2-4天體重將發(fā)生一定程度的降低。之后大鼠體重開始呈現(xiàn)穩(wěn)定增長，但仍然顯著低于空白組，且戊己丸給藥組的低和高劑量組與模型組相比有顯著性差異。

3.2戊己丸對IBD大鼠DAI評分的影響

在整個實驗過程中，與空白對照組相比，模型組大鼠在TNBS乙醇溶液刺激后DAI 評分顯著降低。戊己丸和美沙拉嗪給藥各組較模型組DAI評分有所升高。

3.3戊己丸對IBD大鼠相關生化指標的影響

在造模給藥后，與空白對照組相比，模型組小鼠在TNBS乙醇溶液刺激后血清中炎性因子IL-1β、TNF-α顯著升高。戊己丸和美沙拉嗪給藥各組較模型組炎性因子有一定程度的降低。

4小結

在TNBS乙醇溶灌腸模型上，研究發(fā)現(xiàn)戊己丸給藥后可以顯著改善TNBS乙醇所致的DAI評分降低、炎癥因子升高。本研究證明了戊己丸的改善嚴重性腸病藥效，也驗證了TNBS乙醇溶灌腸模型評價治療IBD功效的有效性。

1實驗材料 1.1實驗動物

SD雄鼠10x2=20只（購自北京市維通利華實驗動物技術有限公司），6周齡，體重220-240g，許可證號：SCXK（京）2021—0011、SCXK（京）2021—0006。動物購入后于SPF級動物房中飼養(yǎng)。自由進食給水，保持實驗室安靜，實驗室溫度22-25oC，濕度50-60%，明暗周期12h/12h。

1.2實驗材料

TNBS（sigma）、糞便隱血試劑盒（雷根生物）、

戊巴比妥鈉（sigma）

2實驗方法 2.1分組及實驗

適應性飼養(yǎng)4d，根據(jù)體重將動物隨機分為以下2組（n=10）。1組為空白組，1組為模型組。各組動物于同一天進行解剖取材。

實驗期間記錄大鼠體重，3周后進行取材。

2.2DAI 評分 2.2.1體重變化

每日密切觀察大鼠動物狀態(tài)，稱重，記錄體重。

2.2.2糞便形態(tài)

大鼠每天觀察大鼠糞便形態(tài)，記錄，包括：正常、軟便、便不成型、粘液狀。

2.2.3糞便隱血檢測

觀察大鼠糞便顏色是否有血，將無明顯顏色變化的大鼠糞便進行糞便隱血檢測，并記錄結果。

2.3取材及生化檢測

在戊巴比妥鈉麻醉下取血、結腸組織用于后期生化指標測量。取得血靜置4h后，3500r/ min，15min離心得血清。對結腸組織劑型直觀觀察，對結腸黏膜損傷情況進行評分；稱重，測量結腸組織重量及長度。

結腸組織立即用 4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水、二甲苯透明，然后進行浸蠟、包埋、切片、脫蠟、染色、脫水、透明、封片等步驟。蘇木精-伊紅染色后，在顯微鏡下觀察各組結腸組織形態(tài)的病理學變化并拍照。使用ELISA 試劑盒（IL-6、IL-1β、TNF-α），按照試劑盒內說明書方法操作對血清中炎癥因子進行檢測。

2.4數(shù)據(jù)分析

實驗結果以均數(shù)±標準誤（Mean ± SEM）表示，采用SPSS 25.0進行統(tǒng)計分析，P < 0.05為產(chǎn)生統(tǒng)計學差異。

1. 目的

通過化學誘導的方法，構建能夠很好模擬當今社會人們所處的工作環(huán)境、生活狀態(tài)等因素而引起的炎癥性腸?。喝缟罘绞缴盍晳T的改變、腹痛腹瀉、腸道菌群紊亂、免疫持續(xù)激活以及工作和生活所帶來的生理和心理壓力等等，以用于改善炎癥性腸病藥品和保健品的功效評價。

2. 意義

隨著社會的進步和高速發(fā)展，人們的生活節(jié)奏及生活方式發(fā)生改變，家庭遺傳因素，免疫持續(xù)激活，腸道內菌群紊亂，腸粘膜屏障防御功能減弱等因素影響，身體出現(xiàn)腹痛、腹瀉、便血、體重減輕等癥狀。當今，炎癥性腸病發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重影響患者的自我效能，降低生活質量，已成為不容忽視的健康問題。隨著生活水平的提高，人們對保健品和藥品的需求也在不斷增大，通過服用具有緩解腹痛腹瀉的保健品和減輕炎癥損傷的藥品可以降低或消除機體腹痛腹瀉、便血的現(xiàn)象，使其體力恢復到正常。因此，建立穩(wěn)定的炎癥性腸病動物模型和功效評價方法就顯得尤為重要。目前常用的方法是采用正常動物通過化學誘導炎癥性腸?。↖BD）模型。本研究采用化學誘導模型，即TNBS乙醇溶液灌腸的方法，造成動物腸粘膜局部免疫紊亂的狀態(tài)，能很好地模擬當今人們因長期免疫應激所導致的炎癥性腸病狀態(tài)，如腹痛腹瀉、便血、以及工作和生活所帶來的生理和心理壓力等。該類模型具有快速誘導炎癥、易操作性和花費少的特點。

3. 國內外研究進展

國內外文獻中已報道的造成炎癥性腸病動物模型的方法有：化學誘導、免疫和炎癥、大腸桿菌誘導等單一因素或多種因素誘導的方法構建的一系列用于炎癥性腸病研究的動物模型[1]。而在這些方法中，化學誘導是最為常用的造成炎癥性腸病的方法，如飲用DSS、TNBS灌腸、惡唑酮皮膚表面滴注及灌腸等。如：I Okayasu等對小鼠予飲用水中添加一定分子量的DSS，就可導致不同程度的炎癥性腸病模型[2]；取4%~10%的乙酸1.5 mL灌入大鼠結腸內5~8 cm處，10~20 s后用0.9%氯化鈉3~5 mL沖洗1次[3]；取一定量的OXZ乙醇溶液一次性經(jīng)導管(距肛4 cm)灌注入結腸內[4]；用降解的1%角叉菜膠水溶液飼喂動物,數(shù)周后實驗動物可導致UC。[5]；基因敲除和轉基因誘導炎癥性腸病模型[6]。盡管這些誘導方法能夠模擬當今人們的病理狀態(tài)，但因為病變自愈能力不同、維持時間不一，重復性差，死亡率高等，造模參數(shù)各異。

我們采用SD雄性小鼠，禁食24小時后麻醉，用長約15 cm，直徑2 mm的硅膠管 (或聚乙烯導管) 由肛門輕緩插入8 cm處的腸腔內，注入50~150 mg/kg的30%~50%TNBS乙醇溶液，約2小時大鼠蘇醒前，再次用造模液刺激，用膠帶封住肛門部位，使造模液全部被腸腔吸收。表現(xiàn)在造模后2-4天體重連續(xù)下降、糞便松軟、且?guī)а螂[血、精神狀態(tài)萎靡、自主活動減弱。

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